動(dòng)物模型的制備和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室開展。動(dòng)物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

1．中性粒細(xì)胞的形態(tài)及生化特征

原始中性粒細(xì)胞的發(fā)育首先由髓系祖細(xì)胞經(jīng)譜系決定，發(fā)育成粒細(xì)胞前體細(xì)胞，再由粒細(xì)胞前體細(xì)胞經(jīng)過增殖，分化和成熟形成有功能的中性粒細(xì)胞。在斑馬魚中，區(qū)分中性粒細(xì)胞可通過以下形態(tài)學(xué)與細(xì)胞學(xué)方法[1,2]：（1）成熟的中性粒細(xì)胞最顯著的形態(tài)學(xué)特征為含有分葉核以及大量顆粒的細(xì)胞質(zhì)，可以在循環(huán)系統(tǒng)以及結(jié)締組織中被很清晰地辨認(rèn)。（2）還可以通過分子標(biāo)記來(lái)分辨不同成熟時(shí)期的中性粒細(xì)胞。已經(jīng)有研究報(bào)道的粒細(xì)胞特異分子標(biāo)記有轉(zhuǎn)錄因子C/ebp1，粒細(xì)胞顆粒中含有的髓過氧化物酶（Mpx）、溶菌酶C（Lyz）等。（3）另外，還可通過檢測(cè)細(xì)胞的激活、趨化、變形運(yùn)動(dòng)能力、及吞噬、殺菌作用來(lái)辨別。（4）此外中性粒細(xì)胞可被蘇丹黑B（Sudanblack B，SB）特異性染色，并且可根據(jù)染色程度來(lái)辨別不同分化過程的中性粒細(xì)胞。

2．中性粒細(xì)胞與病原菌感染

中性粒細(xì)胞是一種具有多形核的白細(xì)胞，是人體固有免疫中的重要組成成分，在機(jī)體抵抗病原菌感染時(shí)起著重要的作用。中性粒細(xì)胞在體內(nèi)含量豐富，大約占人體白細(xì)胞總數(shù)的40%-75%[3]，并且在機(jī)體遭受病原菌感染時(shí)，中性粒細(xì)胞能夠迅速的從血管中遷移到感染部位[4]。當(dāng)中性粒細(xì)胞到達(dá)感染處后，主要通過兩種方式來(lái)抵抗感染，一種是分泌大量的細(xì)胞因子和趨化因子，比如IL-1b[5], IL-18[6], LL-37[7] ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 等，這些小分子能夠招募和激活更多的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞到達(dá)感染部位，共同抵抗感染。另一方面，中性粒細(xì)胞還能夠直接吞噬和消化病原菌，這主要依賴于斑馬魚中性粒細(xì)胞中含有豐富的顆粒酶。中性粒細(xì)胞內(nèi)含有多種顆粒，這些顆粒富含各種殺菌作用的蛋白，并且在終末分化完成之前各種富含不同組分的顆粒必須組裝完成（如圖1所示）。中性粒細(xì)胞中三種顆粒分別是（1）嗜天青顆粒：又稱初級(jí)顆粒，在早幼粒細(xì)胞中數(shù)量最多，顆粒中含有髓過氧化物酶、溶菌酶及較多的水解酶。（2）特異顆粒：又稱次級(jí)顆粒，其中含有乳鐵蛋白、溶菌酶等，顆粒膜上有多種CD抗原和受體。（3）白明膠酶顆粒：含白明膠酶、溶菌酶[8]。這些顆粒主要通過兩種方式來(lái)殺滅病原菌。一種是氧依賴性殺菌途徑，主要通過激活膜結(jié)合成分NADPH系統(tǒng)，產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）來(lái)直接氧化并殺死病原菌[9]；另一種方式是通過氧非依賴性方式來(lái)消化破壞病原菌的細(xì)胞膜或壁結(jié)構(gòu)的完整性[10,11]，從而通過使病原菌失去滲透壓而死亡。但是目前對(duì)這些顆粒酶的研究大多數(shù)是在體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的，大部分顆粒酶的體內(nèi)功能是未知的。因此了解和研究這些顆粒酶的成分以及顆粒酶的功能有助于研發(fā)新的抗菌酶。

圖1. 中性粒細(xì)胞中所含的顆粒酶種類，引用自Borregaard 等[12]。

3．斑馬魚Npsn蛋白的簡(jiǎn)介

Npsn最早在鯉魚（Cyprinus carpio）的淋系造血組織中發(fā)現(xiàn)，屬于蝦紅素蛋白家族（astacinfamily）的一員，并且具有肽鏈內(nèi)切酶活性[13]。蝦紅素蛋白家族屬于金屬鋅蛋白酶超家族的一員，在蛋白質(zhì)消化、個(gè)體背腹軸確定以及形態(tài)發(fā)生中起著重要的作用[14]。研究者通過對(duì)比鯉魚的Npsn的蛋白序列與其他物種的同蛋白家族酶的相似性，發(fā)現(xiàn)Npsn與medaka的孵化酶有大于50%的序列相似性，但是作者并沒有在鯉魚的孵化液中檢測(cè)到Npsn的存在，所以作者猜測(cè)Npsn可能沒有孵化酶的活性。而關(guān)于Npsn的另一個(gè)研究是在斑馬魚中進(jìn)行的，作者通過分析斑馬魚造血組織的ESTs序列以及整體原位雜交（Whole-mount In Situ Hybridization, WISH）實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了三個(gè)新的特異性表達(dá)在斑馬魚血管以及造血組織中的基因，Npsn就是其中的一個(gè)[15]。并且作者通過雙色原位雜交進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Npsn可能表達(dá)在斑馬魚的中性粒細(xì)胞中。根據(jù)以上前人的研究，我們猜測(cè)，Npsn可能是斑馬魚中性粒細(xì)胞中的一種顆粒酶，然而 Npsn在中性粒細(xì)胞中的作用，以及是否參與到宿主先天免疫至今尚未有研究。

4．斑馬魚在作為研究中性粒細(xì)胞顆粒酶功能的模式生物中的優(yōu)越性

近幾十年來(lái)，斑馬魚逐漸成為一種強(qiáng)大的工具來(lái)研究感染類疾病，除了斑馬魚的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)外，在研究中性粒細(xì)胞和病原菌的相互關(guān)系中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先，斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育過程是保守的，都是起源于造血干細(xì)胞，通過早幼粒、中幼粒最終發(fā)育成為成熟的帶有分頁(yè)核的粒細(xì)胞[12]。其次，斑馬魚中成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以用熒光蛋白標(biāo)記中性粒細(xì)胞，進(jìn)而在活體實(shí)時(shí)觀察中性粒細(xì)胞對(duì)病原菌的響應(yīng)以及吞噬病原菌的過程[16]。第三，利用微分干涉相差顯微鏡顯微鏡（DIC）可以清晰看到中性粒細(xì)胞所含的顆粒酶，以及顆粒酶的發(fā)育過程。

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