國(guó)際上此前雖然有過(guò)PON1基因敲除小鼠的研究報(bào)道，但只是聚焦于PON1基因敲除提高巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激和動(dòng)脈粥樣硬化疾病相關(guān)的研究[19]，沒(méi)有敲除大鼠以及免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)報(bào)道。目前，僅有我們首次報(bào)道了PON1基因敲除大鼠的建立以及有關(guān)免疫T細(xì)胞發(fā)育受損的研究，以及關(guān)于PON1基因敲除大鼠腦部小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨淖钚碌难芯砍晒鸞20]，因此PON1基因敲除大鼠模型的建立以及利用該動(dòng)物模型開(kāi)展的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥表型研究和分子機(jī)制研究，為免疫學(xué)和神經(jīng)炎癥研究提供了工具動(dòng)物模型支撐。大鼠資源詳見(jiàn)（SD.Pon1(tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）

模型制作及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ZLF18002和ZLF18003。本實(shí)驗(yàn)部分使用了基因修飾動(dòng)物（基因敲除），如果動(dòng)物逃逸，將會(huì)造成的環(huán)境潛在的基因污染。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖于三樓動(dòng)物房屏障環(huán)境中，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保證動(dòng)物處于監(jiān)管狀態(tài)，無(wú)逃脫可能。動(dòng)物房出入口安放擋鼠板，嚴(yán)防動(dòng)物逃逸，定期對(duì)門(mén)窗進(jìn)行檢查，保證嚴(yán)密，動(dòng)物籠具一經(jīng)發(fā)現(xiàn)破損，立即更換，飼養(yǎng)人員出入確保動(dòng)物房門(mén)關(guān)緊并鎖住等。含重組DNA的廢棄核酸樣品、離心管、槍頭等用1M NaOH溶液浸泡后，裝入密封袋中，統(tǒng)一送到化學(xué)廢棄物處理公司處理。

1.PON1基因敲除大鼠的蛋白表達(dá)鑒定。

1.1 PON1蛋白在基因敲除大鼠的腦組織和小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)缺失。

圖2 PON1在腦和小膠質(zhì)細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平鑒定

1.2 PON1蛋白在基因敲除大鼠的胸腺組織表達(dá)缺失。

圖3 PON1在脾和胸腺免疫器官中的蛋白表達(dá)水平鑒定

1.3 PON1敲除降低LPS誘導(dǎo)致死率。

圖4 PON1敲除大鼠和野生型大鼠LPS實(shí)驗(yàn)中的生存率分析

1.4 PON1 敲除降低LPS誘導(dǎo)后血清中的TNF-α水平。

圖5 PON1敲除大鼠和野生型大鼠LPS實(shí)驗(yàn)血清的ELISA分析

圖6 PON1敲除大鼠和野生型大鼠神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫組化分析

1.6 PON1 基因敲除可使小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生抑炎、促吞噬的表型。

1.6.1 PON1敲除大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能增強(qiáng)

圖7 PON1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能的調(diào)節(jié)

1.6.2 PON1 敲除降低LPS誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子分泌

圖8 利用Luminex 和ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的分泌水平。

1.6.3 PON1敲除導(dǎo)致胸腺變小，胸腺細(xì)胞減少

圖9 PON1敲除大鼠和野生型大鼠胸腺細(xì)胞對(duì)比分析

1. 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司和北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器

Nikon顯微注射儀

Nikon光學(xué)顯微鏡

BIO-RAD電泳儀

Tanon電泳槽

Tanon數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)

Incucell恒溫培養(yǎng)箱溫控

TAITEC振蕩箱

Eppendorf離心機(jī)

Eppendorf移液器

2.實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程和動(dòng)物處理倫理

模型制作中涉及動(dòng)物的操作程序已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ZLF18003，簡(jiǎn)要步驟如下：

2.1 供卵雌鼠超排

實(shí)驗(yàn)第一天8：00腹腔注射PMSG30IU/只(0.6ml／只)，46～48h以后，實(shí)驗(yàn)第三天10：00腹腔注射HCG30IU/只(0.6ml／只)，注射HCG后立即與與種鼠1：1合籠。實(shí)驗(yàn)第四天8：00～9：00檢查陰道栓，有陰道栓的大鼠在大鼠標(biāo)牌上注明日期和⊕（陽(yáng)性），撿出有陰栓的大鼠進(jìn)行受精卵的收集。

2.2 受精卵的收集

2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，脫頸處死，解剖大鼠，找到卵巢，輸卵管和子宮，將卵取出，用透明質(zhì)酸酶消除胚泡的黏著，使卵分離。在移換到另外的培養(yǎng)液中，要將透明質(zhì)酸酶充分洗凈（洗約3~5次）。

2.3 向受精卵雄性原核注入DNA溶液

2.4. 僅將未損壞的完成操作的卵收集起來(lái)，移植到假妊娠大鼠輸卵管中。術(shù)后將大鼠置于安靜的環(huán)境下飼養(yǎng)。

2.5 基因表型鑒定

在判定有導(dǎo)入基因大鼠之后，立即將基因修飾大鼠另行飼養(yǎng)，對(duì)不用的大鼠進(jìn)行處理。陰性大鼠的處理：（1）留和陽(yáng)性大鼠等量的陰性大鼠對(duì)照。（2）剩余的陰性大鼠用于其它符合動(dòng)物倫理的其他實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)（保存記錄）。

3. PON1基因敲除靶點(diǎn)設(shè)計(jì)與測(cè)序鑒定

利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立基因敲除大鼠，sgRNA 的作用靶點(diǎn)位于第四外顯子。通過(guò)顯微注射成功獲得敲除大鼠，其中首建鼠F0（#20）敲除片段大小為342bp，能夠穩(wěn)定傳代。PON1 雜合子大鼠之間雜交得到同窩陰性對(duì)照大鼠和敲除純合子用于實(shí)驗(yàn)研究。大鼠模型資源詳見(jiàn)（SD.Pon1(tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）

圖1 PON1基因敲除設(shè)計(jì)策略

一、疾病概述

我們的模型研究結(jié)果證實(shí)PON1敲除損傷免疫T細(xì)胞的發(fā)育，并顯著調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞的極化，之前的文獻(xiàn)報(bào)道揭示了PON1參與抑制單核-巨噬細(xì)胞的分化，均提示PON1可作為一種新的免疫調(diào)節(jié)因子。該動(dòng)物模型涉及到小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的炎癥反應(yīng)和T細(xì)胞發(fā)育兩方面，分述如下：

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)常駐的免疫細(xì)胞，數(shù)量約占人腦細(xì)胞總數(shù)的0.5-16.6%，又稱(chēng)腦內(nèi)的巨噬細(xì)胞，構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第一道防線。生理狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞處于相對(duì)的靜息狀態(tài)，因此被稱(chēng)為靜息型小膠質(zhì)細(xì)胞(resting microglia)。靜息型小膠質(zhì)細(xì)胞在發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中起著調(diào)控神經(jīng)元存活和修飾突觸的作用，并且在成熟的健康腦中具有探測(cè)和調(diào)控神經(jīng)元活動(dòng)的功能；在炎癥刺激病理狀態(tài)下，包括在腦損傷、病原入侵以及退行性疾病中，小膠質(zhì)細(xì)胞首先啟動(dòng)，遷移至損傷部位，轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)，呈現(xiàn)阿米巴蟲(chóng)樣的典型巨噬細(xì)胞形態(tài)，因此被稱(chēng)為阿米巴樣小膠質(zhì)細(xì)胞(amoebic microglia)。小膠質(zhì)細(xì)胞激活大體分為M1經(jīng)典激活型和M2選擇激活型。M1型為促炎狀態(tài)，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的促炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α、白介素1β、白介素6或白介素12，這些炎性因子會(huì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用, 嚴(yán)重的會(huì)致使神經(jīng)細(xì)胞凋亡；M2型為抗炎狀態(tài)，能夠釋放抗炎性細(xì)胞因子如白介素4、白介素13，吞噬損傷的神經(jīng)細(xì)胞碎片、促進(jìn)組織修復(fù)和神經(jīng)元的再生。

神經(jīng)炎癥反應(yīng)是許多神經(jīng)退行性病變的重要病理基礎(chǔ)，在神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷后的神經(jīng)退變中也發(fā)揮重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)吞噬作用清除細(xì)胞碎片，并釋放神經(jīng)生長(zhǎng)及抗炎因子而減輕神經(jīng)損傷，促進(jìn)組織修復(fù)。然而很明顯，小膠質(zhì)細(xì)胞高度活化狀態(tài)可釋放高水平的促炎因子及細(xì)胞毒性物質(zhì)，從而造成神經(jīng)元失能及細(xì)胞死亡。神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞及浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性。

胸腺是機(jī)體的重要免疫器官，由皮質(zhì)和髓質(zhì)兩部分組成，主要包括胸腺上皮細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)是淋巴細(xì)胞的一種,在免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色。T細(xì)胞在胸腺中發(fā)育經(jīng)歷CD4-CD8-(Double negative,DN)、CD4+CD8+(Double positive,DP)及CD4+或CD8+(Singlepositive,SP)三個(gè)主要階段,最后進(jìn)入外周淋巴組織。胸腺病變將對(duì)機(jī)體免疫功能帶來(lái)嚴(yán)重影響，使機(jī)體免疫自穩(wěn)功能紊亂并伴發(fā)自身免疫性疾病。但是，目前對(duì)于胸腺發(fā)育和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的分子機(jī)制仍不清楚。

二、模型背景

1、PON1信息

人類(lèi)的對(duì)氧磷酶家族包括3個(gè)成員即PON1、PON2 和PON3，其中PON1是由354 個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量約為43000～47000的糖蛋白。目前的研究表明，PON1 主要由肝臟合成，大部分結(jié)合在肝臟細(xì)胞內(nèi)微粒體上，在人體廣泛分布于肝臟、血液、腎臟、脾臟、腸及腦，其中在肝臟和血液中活力最高。PON1 在血液中借助于疏水的N 端和載脂蛋白AI 緊密結(jié)合，固定于高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)顆粒上。PON1 因能水解對(duì)氧磷而命名為對(duì)氧磷酶，實(shí)際上PON1 是一個(gè)可以水解多種內(nèi)源或外源物質(zhì)的、多功能的水解酶，其底物可歸為芳香類(lèi)和內(nèi)脂類(lèi)二類(lèi)。PON1 參與脂代謝、藥物代謝和毒物代謝等多種病理和生理過(guò)程。與心腦血管病，糖尿病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病等多種疾病有關(guān)。

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

SD大鼠

3、研究背景

該動(dòng)物模型的研究目的及意義；該動(dòng)物模型的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展并附參考文獻(xiàn)。

3.1該動(dòng)物模型的研究目的及意義

對(duì)氧磷酶1（paraoxonase 1, PON1）是AD 的風(fēng)險(xiǎn)基因，PON1 與AD 的關(guān)系目前停留在流行病調(diào)研水平，機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。PON1 是否也通過(guò)抗氧化或抗炎癥作用抵抗AD 的發(fā)生發(fā)展，機(jī)制如何，仍有待開(kāi)展更多研究工作加以論證。PON1基因敲除大鼠可以用于研究PON1功能缺失對(duì)于免疫功能的影響。

更深入地講，小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用是阿爾茨海默病中Aβ清除的主要途徑之一。TREM2已經(jīng)成為近五年國(guó)內(nèi)外AD 研究前沿?zé)狳c(diǎn)和潛在治療靶點(diǎn)之一。TREM2 可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞由M1 型（神經(jīng)損傷）向M2 型（神經(jīng)保護(hù)）轉(zhuǎn)變，是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的重要信號(hào)蛋白[1]。最新證據(jù)顯示，在小鼠模型中TREM2 除了能減少與AD 相關(guān)的病理，還能夠緩解認(rèn)知功能上的缺陷[2, 3]。這提示使用大腦現(xiàn)有的免疫機(jī)制來(lái)清除淀粉樣蛋白可以作為一種治療AD 的新策略，可通過(guò)上調(diào)TREM2 的表達(dá)或激活TREM2 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。我們的研究發(fā)現(xiàn)PON1與TREM2之間存在互作關(guān)系，我們利用PON1基因敲除大鼠，展開(kāi)研究將深化對(duì)這一腦內(nèi)免疫機(jī)制的理解。

3.2 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

在過(guò)去20年，PON1的研究主要集中在心腦血管病方面，一是PON1多態(tài)性與粥樣硬化、冠心病、腦梗死等的相關(guān)性[4, 5]；二是PON1 在血漿中的水平作為心腦血管病預(yù)警標(biāo)志物研究。在PON1 分子機(jī)制方面反而沒(méi)有大的進(jìn)展，僅僅報(bào)道了PON1在脂代謝和血管疾病中的可能發(fā)揮抗炎和抗氧化作用[6-10]。

迄今，PON1 與AD 等神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系目前停留在流行病調(diào)研水平，研究認(rèn)為PON1的多態(tài)性是AD或PD的危險(xiǎn)因子或某些多態(tài)性攜帶者對(duì)環(huán)境致病因素更敏感[11-16]，血漿中的PON1 低活性也是AD 的危險(xiǎn)因素[17, 18]，因此PON1是AD和PD的風(fēng)險(xiǎn)基因，然而，PON1參與AD的分子機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

國(guó)際上此前雖然有過(guò)PON1基因敲除小鼠的研究報(bào)道，但只是聚焦于PON1基因敲除提高巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激和動(dòng)脈粥樣硬化疾病相關(guān)的研究[19]，沒(méi)有PON1基因敲除大鼠及調(diào)節(jié)免疫的相關(guān)報(bào)道。目前，僅有我們首次報(bào)道了PON1基因敲除大鼠的建立以及有關(guān)免疫T細(xì)胞發(fā)育受損的研究，以及關(guān)于PON1基因敲除大鼠腦部小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨淖钚碌难芯砍晒鸞20]，因此PON1基因敲除大鼠模型的建立以及利用該動(dòng)物模型開(kāi)展的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥表型研究和分子機(jī)制研究，為AD和神經(jīng)系統(tǒng)研究提供了工具動(dòng)物模型支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1] Zhai, Q., et al., Triggering Receptor Expressed on MyeloidCells 2, a Novel Regulator of Immunocyte Phenotypes, Confers Neuroprotection byRelieving Neuroinflammation. Anesthesiology, 2017. 127(1): p.98-110.

[2] Zhao, Y., et al., TREM2 Is a Receptor for beta-Amyloid thatMediates Microglial Function. Neuron, 2018. 97(5): p. 1023-1031e7.

[3] Lee, C.Y.D., et al., Elevated TREM2 Gene Dosage ReprogramsMicroglia Responsivity and Ameliorates Pathological Phenotypes in Alzheimer'sDisease Models. Neuron, 2018. 97(5): p.1032-1048 e5.

[4] Kowalska, K., E. Socha, and H. Milnerowicz, Review: The role of paraoxonase incardiovascular diseases. Ann Clin Lab Sci, 2015. 45(2): p.226-33.

[5] Mackness, M. and B.Mackness, Human paraoxonase-1 (PON1):Gene structure and expression, promiscuous activities and multiplephysiological roles. Gene, 2015. 567(1): p. 12-21.

[6] Aviram, M. and J.Vaya, Paraoxonase 1 activities,regulation, and interactions with atherosclerotic lesion. Curr OpinLipidol, 2013. 24(4): p. 339-44.

[7] Mackness, M. and B. Mackness, Targeting paraoxonase-1 in atherosclerosis. Expert Opin Ther Targets,2013. 17(7): p. 829-37.

[8] Eren, E., N. Yilmaz,and O. Aydin, Functionally defectivehigh-density lipoprotein and paraoxonase: a couple for endothelial dysfunctionin atherosclerosis. Cholesterol, 2013. 2013: p. 792090.

[9] Mineo, C. and P.W. Shaul, PON-dering differences in HDL function in coronary artery disease. JClin Invest, 2011. 121(7): p. 2545-8.

[10] Perla-Kajan, J. and H. Jakubowski, Paraoxonase 1 and homocysteine metabolism. AminoAcids, 2012. 43(4): p. 1405-17.

[11]Bednarska-Makaruk,M.E., et al., Paraoxonase 1 (PON1)gene-108C>T and p.Q192R polymorphisms and arylesterase activity of theenzyme in patients with dementia. Folia Neuropathol, 2013. 51(2): p.111-9.

[12] Cagnin, A., et al., LDL density and oxidation aremodulated by PON1 promoter genotype in patients with Alzheimer's disease. JAlzheimers Dis, 2013. 34(2): p. 377-85.

[13] He, X.M., et al., Gln192Arg polymorphism in paraoxonase 1gene is associated with Alzheimer disease in a Chinese Han ethnic population.Chin Med J (Engl), 2006. 119(14): p. 1204-9.

[14] Akhmedova, S.N., A.K. Yakimovsky, and E.I. Schwartz,Paraoxonase 1 Met--Leu 54 polymorphism is associated with Parkinson's disease.J Neurol Sci, 2001. 184(2): p. 179-82.

[15] Manthripragada, A.D., et al., Paraoxonase 1, agriculturalorganophosphate exposure, and Parkinson disease. Epidemiology, 2010. 21(1): p.87-94.

[16] Atasoy, H., et al., Paraoxonase1 192 (PON1 192) genepolymorphism and serum paraoxonase activity in panic disorder patients. InVivo, 2015. 29(1): p. 51-4.

[17] Erlich, P.M., et al., Serum paraoxonase activity isassociated with variants in the PON gene cluster and risk of Alzheimer disease.Neurobiol Aging, 2012. 33(5): p. 1015 e7-23.

[18] Bednarska-Makaruk, M., et al., Positive correlation ofparaoxonase 1 (PON1) activity with serum insulin level and HOMA-IR in dementia.A possible advantageous role of PON1 in dementia development. J Neurol Sci,2013. 324(1-2): p. 172-5.

[19] Rozenberg O , Rosenblat M , Coleman R , et al.Paraoxonase (PON1) deficiency is associated with increased macrophage oxidativestress: studies in PON1-knockout mice[J]. Free Radical Biology & Medicine,2003, 34(6):774-784.

[20] Lin Bai, Guiying Shi, Yuanwu Ma, Li Zhang,Feifei Guan, XuZhang, Yanfeng Xu, Houzao Chen & Lianfeng Zhang. Paraoxonase1 knockout ratshave impaired T cell development at the CD4/CD8 double-negative todouble-positive transition stage. Sci Rep, 2018. 8(1): p. 14457.