動(dòng)物癥狀觀察：

表現(xiàn)為體重減輕、弓背豎毛，在回輸后的一個(gè)月后死亡。

實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)(ILAS-GC-2012-001)。

1、D5基因敲除及高鹽飲食小鼠血壓情況

高鹽喂養(yǎng)8周后，通過左頸動(dòng)脈插管法檢測小鼠的血壓，我們發(fā)現(xiàn)，Drd5多巴胺受體5受體敲出小鼠的血壓相比于野生型小鼠明顯升高。給予高鹽飲食之后，多巴胺受體5受體（Drd5）敲出小鼠進(jìn)一步升高。而野生型小鼠的血壓沒有明顯升高。說明多巴胺受體5 （Drd5）受體敲出小鼠確實(shí)能夠參與小鼠血壓的調(diào)節(jié)。

2、D5基因敲除小鼠腎臟NA離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)情況

為了進(jìn)一步確定Drd5受體敲除后，小鼠腎臟鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)情況，我們提取了D5+/+小鼠以及D5-/-小鼠腎臟組織的膜蛋白，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組D5+/+小鼠相比，基因敲除組D5-/-小鼠腎臟組織NaPi2、NCC、ENaC、NKA等蛋白的表達(dá)顯著升高。這說明D5受體缺失之后，腎臟鈉離子調(diào)控失調(diào)，致使大量鈉離子聚集，進(jìn)一步誘發(fā)鈉水平衡失調(diào)以及高血壓的發(fā)生發(fā)展。

3、D5基因敲除小鼠NADPH氧化酶活性情況

為檢測D5受體對(duì)NADPH氧化酶的影響，我們用第六代的D5-/-和D5+/+小鼠作為研究對(duì)象。ROS作為EH病理生理發(fā)生的一個(gè)因素，在心血管系統(tǒng)、腎臟中，主要是由NADPH氧化酶產(chǎn)生，因此，我們比較分析了D5-/-和D5+/+小鼠腎臟NADPH氧化酶的表達(dá)和活性。P47 (分子量47kDa)是腎臟NADPH氧化酶的細(xì)胞漿內(nèi)的一個(gè)組成多肽，為此，我們檢測P47的含量代表NADPH腎臟組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示：D5-/-鼠腎臟P47的表達(dá)量約是D5+/+小鼠的2倍。

進(jìn)一步對(duì)NADPH氧化酶的活性測定發(fā)現(xiàn)：D5-/-小鼠腎臟NADPH氧化酶的活性明顯高于和D5+/+小鼠，同時(shí)經(jīng)DPI處理的標(biāo)本，幾乎檢測不到NADPH氧化酶的活性，證明了檢測NADPH氧化酶活性方法的特異性。分析結(jié)果表明，多巴胺通過D5，受體抑制NADPH氧化酶的表達(dá)和活性。

4、D5基因敲除小鼠ROS產(chǎn)生的情況

NOX家族均可誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，定位于質(zhì)膜上，可感受細(xì)胞外刺激信號(hào)，是信號(hào)分子的ROS主要來源。因此我們檢測了腎臟組織膜蛋白NOX4表達(dá)的情況。蛋白印記結(jié)果顯示，D5-/-小鼠腎臟NOX4的表達(dá)顯著高于和D5+/+小鼠。腎臟NOX4的高表達(dá)也提示D5基因?qū)δI臟ROS表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)腎臟組織損傷，進(jìn)一步加劇高血壓的發(fā)生發(fā)展。

1.C57小鼠，名稱：C57，近交系（Inbred Rat）

品系來源 ：1)遺傳背景及亞系:1921年Ltle用 Abbg Lathrop的小鼠株雌鼠57號(hào)與雄鼠52號(hào)交配，而得C57BL6。亞系:C57BL6、C57B/6、C57BL/6N等。 (2)毛色基因標(biāo)記：aa、BB、CC（黑色）

(3)主要遺傳學(xué)特征：a免疫學(xué)特征：一般飼養(yǎng)條件下免疫球蛋白的量隨年齡而增加，而到生后20個(gè)月時(shí)則1gG增長緩慢，無菌飼養(yǎng)的絕對(duì)量較低。gM水平較高，出生12月以后，有的個(gè)體超過80ug/mL。無菌飼養(yǎng)的動(dòng)物lgM量比一般飼養(yǎng)的高。細(xì)胞免疫低下者少見，這可能與自發(fā)腫瘤少有關(guān)。b。形態(tài)學(xué)特征：在新生鼠中，雌鼠為16.8%，雄鼠3%為小眼或無眼癥。0.6%后肢可見多趾癥，另外水頭癥占2%4%，耳頭癥占0.4%，交合不全占3%。c生理學(xué)特性：有強(qiáng)嗜酒精性。對(duì)放射性照射為中等強(qiáng)度感應(yīng)度，LD50為630+4R，將雄鼠皮膚移植到同系的雌鼠身上，約20日被排斥掉，這是因?yàn)樵诮M織相容性抗原中的雄抗原在C57BL中非常顯著。d癌發(fā)生率：乳癌發(fā)生率低，為01%，白血病為7%-16%化學(xué)致癌成功率低，放射性照射較容易誘發(fā)肝癌。

2.高血壓對(duì)照小鼠：C57小鼠，名稱：C57，同類系（Consomic Rat）

3.誘導(dǎo)方法：D5-/-小鼠的獲得：首先獲得構(gòu)件打靶載體，利用同源重組技術(shù)把新霉素抗性基因反向插人到129/sv小鼠胚胎干細(xì)胞有D5受體表達(dá)的第二細(xì)胞內(nèi)環(huán)基因序列中，抑制D5基因的表達(dá)，然后把基因打靶后的胚胎于細(xì)胞注射到c57BL／6小鼠胚泡，繁殖培育后產(chǎn)生純合基因D5-/-.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的D5-/-小鼠第六代3-6個(gè)月齡的小鼠，對(duì)照（D5+/+）小鼠作為對(duì)照。6月齡D5-/-小鼠及其對(duì)照D5+/+，分別給予高鹽飲食（4%的NaCl）和正常鹽飲食（0.4%的NaCl），連續(xù)8周，每周測量血壓。

高血壓是由多基因、多環(huán)境因素及個(gè)人不良習(xí)慣相互作用而導(dǎo)致的一種慢性復(fù)雜疾病，也是危害人類健康的主要疾病之一。鹽是高血壓的重要環(huán)境因素，個(gè)體對(duì)鹽負(fù)荷或限鹽呈現(xiàn)不同的血壓反應(yīng)，因此存在鹽敏感性問題[1]。鹽敏感性是高血壓、心腦血管病和其它疾病（如哮喘、胃癌和腎功能不全等）發(fā)病及致死的一個(gè)潛在危險(xiǎn)因素 [2]。因此在高血壓臨床診治過程中，考慮鹽敏感性將有利于對(duì)高血壓分類、危險(xiǎn)分級(jí)以及對(duì)癥治療。

鹽敏感性通常涉及人口、種族、社會(huì)因素以及腎功能、激素水平和飲食習(xí)慣等[3]。不同種族和人群鹽敏感性個(gè)體的檢出率不同，而且血壓的鹽敏感性隨年齡增長而變化，特別是高血壓患者。鹽敏感性由Weinberger[4]給出定義：靜脈滴注2L生理鹽水，測量平均動(dòng)脈壓（MAP），次日早晨給予低鈉飲食后再測量MAP，兩次MAP相差≥10mmHg為鹽敏感性，否則為鹽耐受性。Yatabe [5]定義鹽敏感指數(shù)（SSI）為低鹽和高鹽飲食后MAP的差值與低鹽飲食MAP的商，若SSI≥5%為鹽敏感性。

對(duì)于鹽敏感性高血壓患者，高鹽攝入引起血壓升高主要有兩方面原因：一方面是腎小管對(duì)Na+ 重吸收增加，導(dǎo)致水鈉潴留，血漿容量增加，從而血壓升高；另一方面是內(nèi)源性哇巴因物質(zhì)分泌增多，特異性抑制鈉泵，胞內(nèi)鈉離子濃度增加，Na+/Ca2+交換體被激活，細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 濃度升高，最終導(dǎo)致血管平滑肌或心肌收縮，引起高血壓 [6].Drd5是多巴胺受體的五種亞型中最特異的受體之一，一種持久的自激活受體，與人類原發(fā)性高血壓和心肌病密切相關(guān)。有研究表明整體D5R基因敲除導(dǎo)致小鼠高血壓和代償性心臟肥大[7]。我們實(shí)驗(yàn)室的研究也表明，Drd5基因敲除能夠誘導(dǎo)小鼠血壓的升高。