采用病毒滴度為104.5 TCID50/ml的EV71（NX10-147）經(jīng)腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，建立重癥小鼠模型，6 dpi重癥模型小鼠發(fā)生后肢癱瘓最終導(dǎo)致死亡；繪制生存率（圖1A），體重增長曲線（圖1B），臨床評分（圖1C）。重癥小鼠模型在5 dpi時，2/7(28.57%)小鼠發(fā)生后肢癱瘓（圖2），在7 dpi時，4/7(57.14%)小鼠表現(xiàn)癱瘓，其體重也下降，11~12 dpi重癥小鼠出現(xiàn)死亡，生存率為71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出現(xiàn)癱瘓后遺癥。

1.重癥小鼠模型各組織病毒載量檢測

為了進(jìn)一步探討重癥EV71小鼠模型體內(nèi)病毒載量情況，采用RT-PCR對3 dpi和5 dpi重癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進(jìn)行病毒核酸檢測（圖3），發(fā)現(xiàn)以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測到EV71病毒，其中，檢測到重癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（107.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重癥模型腦組織中均檢測到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量增加到104.0 copies/mg，說明5 dpi EV71病毒造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染加重。3 dpi在重癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無明顯變化，重癥小鼠模型中均檢測到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說明這些組織是病毒復(fù)制并傳播到腦組織的重要部位。

2.重癥小鼠模型組織病理學(xué)變化

運用組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，對重癥小鼠模型的各組織器官進(jìn)行病理學(xué)觀察。空白對照組小鼠未見明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應(yīng)。

對重癥小鼠模型（NX10-147）進(jìn)行組織病理學(xué)觀察（圖4），發(fā)現(xiàn)3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌發(fā)生嚴(yán)重的壞死性肌炎，肌纖維斷裂，大量炎性細(xì)胞浸潤，主要有淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞；3 dpi 小鼠脊髓和腦干發(fā)生細(xì)胞源性水腫，神經(jīng)元發(fā)生變性，偶見壞死，5 dpi小鼠脊髓前角運動神經(jīng)元變性壞死，出現(xiàn)紅色神經(jīng)元，并可見衛(wèi)星現(xiàn)象和嗜神經(jīng)現(xiàn)象，腦干組織中的神經(jīng)元發(fā)生不同程度的變性壞死，并且可見腦干和脊髓神經(jīng)元中的尼氏小體消失；5 dpi肺臟發(fā)生大面積間質(zhì)性肺炎，間質(zhì)增寬，炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔毛細(xì)血管淤血，3 dpi和5 dpi肺臟發(fā)生局灶性肺氣腫；3 dpi和5 dpi空腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生大面積空泡變性。免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)在上述嚴(yán)重病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖5），在3dpi和5 dpi時，脊髓、腦干、空腸和骨骼肌檢測到較強的陽性EV71抗原信號，提示在這些組織中病毒復(fù)制活躍，然而在5 dpi時，肺臟檢測到中等強度陽性EV71抗原信號。

3.重癥小鼠模型血清細(xì)胞因子檢測

對重癥小鼠模型進(jìn)行血清細(xì)胞因子檢測從血清細(xì)胞因子方面揭示重癥發(fā)生機制。本研究采用CBA方法檢測了重癥小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的動態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重癥小鼠中發(fā)生某時間點的爆發(fā)性濃度增高，與空白對照組小鼠血清因子相比，發(fā)現(xiàn)重癥小鼠血清爆發(fā)性增高的細(xì)胞因子分別是3 hpi重癥IL-5上調(diào)4倍；48 hpi重癥IL-13上調(diào)1.2倍；3 dpi重癥IL-6、MCP-1都上調(diào)100倍以上；3 dpi和7 dpi重癥CCL5/RANTES分別上調(diào)9倍和10倍；重癥小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi時達(dá)到峰值，重癥為10倍；7 dpi重癥TNF-α和MCP-1分別上調(diào)4倍和87倍。以上數(shù)據(jù)說明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠實驗感染早期炎癥反應(yīng)的主要因素，并且細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重癥EV71實驗感染的免疫病理損傷中發(fā)揮重要作用。

4. EV71重癥小鼠模型的氣道阻力和血氣分析

對小鼠的氣道阻力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小鼠的吸氣時間延長，呼吸頻率降低，分鐘通氣量顯著降低，符合限制性通氣不足的特征，可能是小鼠死亡的主要原因之一。

采用血氣分析方法對EV71重癥小鼠模型組和對照組小鼠的呼吸效果進(jìn)行分析，與對照組相比，4 dpi感染組小鼠的氧分壓（PO2）和氧飽和度（sO2）均明顯下降，PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg，差異極顯著（p < 0.01）；sO2由90.6 %下降到76.5 %，差異極顯著（p< 0.01），PO2和sO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠處于缺氧狀態(tài)。并且發(fā)現(xiàn)二氧化碳分壓（PCO2）和二氧化碳總量（TCO2）有所上升，PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg，差異顯著（p< 0.05）；TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L，PCO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠肺通氣效果可能存在障礙。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了血液酸堿度pH值和細(xì)胞外液堿剩余（BEecf）均明顯下降，pH值由7.42下降到7.33，差異顯著（p< 0.05）；BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L，差異顯著（p < 0.05），提示重癥模型組小鼠可能處于呼吸性酸中毒的狀態(tài)。以上血氣結(jié)果結(jié)合肺臟組織病理變化，說明EV71重癥模型組小鼠肺臟通氣功能低下，處于缺氧和呼吸性酸中毒的病理狀態(tài)。

5. EV71小鼠模型超微病理學(xué)變化

對照組小鼠肌肉組織可見橫紋明顯，每條肌原纖維都可見清晰明帶和暗帶交替排列，肌質(zhì)內(nèi)含有豐富的線粒體、肌原纖維、高爾基復(fù)合體、溶酶體、糖原顆粒等肌漿內(nèi)含物，糖原顆粒散在分布于肌原纖維間和肌漿中，肌細(xì)胞內(nèi)可見清晰的線粒體，或在肌纖維間排列，其內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰可見。感染組小鼠肌肉組織超微病變明顯，表現(xiàn)為肌組織橫紋消失，明暗帶模糊甚至消失，肌組織發(fā)生退行性變，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)水腫，部分肌原纖維發(fā)生溶解，肌質(zhì)中的胞漿內(nèi)容物減少，糖原顆粒甚至消失；線粒體腫脹、空化，基質(zhì)電子密度降低，內(nèi)室腫脹，嵴和膜結(jié)構(gòu)模糊，嵴突變短減少，崩解消失，形成灶性空化；骨骼肌細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集，異染色質(zhì)明顯增多，發(fā)生變性、壞死。并且在肌纖維間可見巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。

對照組腦組織中神經(jīng)元胞漿中的細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，平行或不規(guī)則排列，其間游離存在核糖體；線粒體豐富，散布于整個胞體中，線粒體內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰；腦組織中有髓神經(jīng)纖維髓鞘電子密度均勻。感染組腦組織超微病變輕微，神經(jīng)元細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，線粒體豐富；神經(jīng)元胞漿中可見少量空泡，部分線粒體內(nèi)室腫脹；有髓神經(jīng)纖維髓鞘發(fā)生層面分離，導(dǎo)致小泡性分離，呈現(xiàn)泡狀改變。

對照組脊髓前角神經(jīng)元常染色質(zhì)明顯，異染色質(zhì)少，細(xì)胞器豐富；脊髓前角神經(jīng)元胞質(zhì)中線粒體豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)。感染組脊髓前角神經(jīng)元中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，出現(xiàn)尼氏小體溶解，核周見微空泡形成；胞核皺縮，異染色質(zhì)增多，細(xì)胞器減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體呈現(xiàn)不同程度的擴張，細(xì)胞質(zhì)呈篩狀外觀，并伴隨不同程度的多聚核糖體丟失，導(dǎo)致粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒；線粒體腫脹，線粒體嵴突腫脹，嵴數(shù)量減少。小膠質(zhì)細(xì)胞包圍吞噬神經(jīng)元細(xì)胞，呈現(xiàn)嗜神經(jīng)現(xiàn)象。

對照組肺組織中I型上皮細(xì)胞扁平，其細(xì)胞核內(nèi)可見呈淺亮的常染色質(zhì)和呈深色顆粒狀的異染色質(zhì)，胞質(zhì)少而薄，胞漿內(nèi)可見少量細(xì)胞器，與周圍細(xì)胞連接緊密；肺組織中的II型上皮細(xì)胞核大而圓，常染色質(zhì)細(xì)密，異染色質(zhì)少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、溶酶體等細(xì)胞器豐富；II型上皮細(xì)胞胞漿中可見清晰的特征性包含物——嗜鋨性板層小體。感染組肺組織中I型上皮細(xì)胞核中染色質(zhì)邊集，呈不規(guī)則堆積，并且與周圍細(xì)胞之間連接松弛；肺組織中II型上皮細(xì)胞核形狀不規(guī)則，染色質(zhì)邊集，核周細(xì)胞質(zhì)電子密度降低，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器減少，胞質(zhì)出現(xiàn)細(xì)小空泡變，嗜鋨性板層小體或出現(xiàn)排空現(xiàn)象，溶酶體增多；肺泡壁中的細(xì)胞成分增多，其中肺泡II型上皮細(xì)胞增生，發(fā)生了間質(zhì)性肺炎。

H1PV為低于人間傳染病名錄三級安全風(fēng)險的病原，人類感染風(fēng)險低。

H1PV是大鼠必須排除的病原體，對動物有致病性。會干擾其他實驗研究。

鑒于此，此感染實驗必須在BSL-2級以上的生物安全實驗室進(jìn)行病原學(xué)實驗，在ABSL-2實驗室進(jìn)行動物實驗。

pCMV6-XL5-h-SCARB2質(zhì)粒購自美國Origene公司（Clone ID NM_002257）。EcoR I和Xho I酶切回收h-SCARB2片段，并克隆入pCDNA3.1(+)質(zhì)粒中巨細(xì)胞瘤病毒（CMV）啟動子下游，構(gòu)建全身表達(dá)人SCARB2的載體。轉(zhuǎn)基因載體經(jīng)測序驗證后，用Pvu I將載體線性化，Sephedex G50柱純化。將DNA濃度調(diào)整至5 ng/uL，用顯微注射法將DNA注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。經(jīng)鼠尾DNA PCR對首建鼠的基因型進(jìn)行鑒定，得到陽性首建鼠3只（圖1A）。隨后，用逆轉(zhuǎn)錄PCR分析了首建鼠F1代組織中目的基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)人SCARB2主要在轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌和腦組織中表達(dá)（圖1B）。隨后，分別用Western Blot和免疫組化分析了人SCARB2蛋白在腦和骨骼肌組織中的表達(dá)情況。由于人SCARB2與小鼠SCARB2同源性較高，存在抗體交叉結(jié)合現(xiàn)象。Western Blot發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠腦和骨骼肌組織中SCARB2蛋白表達(dá)量高于同窩陰性（圖1C-1D）。免疫組化發(fā)現(xiàn)SCARB2蛋白主要分布于轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌和腦組織中（圖2A-2B），該結(jié)果表明成功建立了腦和肌肉組織表達(dá)人SCARB2蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。

注：M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-15：首建鼠；NTG：同窩陰性小鼠；TG：轉(zhuǎn)基因小鼠；A：PCR鑒定陽性首建鼠；B：逆轉(zhuǎn)錄PCR分析轉(zhuǎn)基因小鼠組織內(nèi)人SCARB2基因表達(dá)；C： Western Blot分析人SCARB2蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中的表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參；D： Western Blot分析人SCARB2蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌組織中的表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參。

Note: M: DNAmolecular weight standard; Lane1-15:Transgenic mouse line; NTG: Negative littermates; TG: Transgenicmice; A:Transgenic mice lines identification by PCR using the tail genomic DNAas template; B: Reverse-transcriptase PCR analysis the human SCARB2 geneexpression in tissues of Tg mice; C: Western blot detected the expression of human SCARB2protein synthesis in brain of Tg mice; D: Western blot detected the expression of human SCARB2protein synthesis in muscle of Tg mice. The data were normalized to GAPDHexpression

EV71感染SCARB2轉(zhuǎn)基因幼鼠表型

為研究表達(dá)人SCARB2對EV71感染轉(zhuǎn)基因小鼠的促進(jìn)作用。我們分別用MP10毒株感染不同年齡段的小鼠，發(fā)現(xiàn)兩周齡以下的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠在感染病毒后，會于10天內(nèi)死亡，肌肉組織內(nèi)病毒載量超過108拷貝/毫克，轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠在病毒復(fù)制方面差別不大。因此，我們用２ ×１０６ ＴＣＩＤ５０MP10毒株200uL分別感染了21日齡的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠，主要研究了表達(dá)人SCARB2受體組織內(nèi)的病毒復(fù)制情況。發(fā)現(xiàn)在感染后3天（病毒復(fù)制的最高峰）轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌和腦中EV71的拷貝數(shù)顯著高于同窩陰性小鼠（圖3A-3B），隨后，用免疫組化研究了組織內(nèi)的病毒分布情況。EV71抗原主要分布于轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中，而野生型小鼠腦組織中未檢測到病毒抗原（圖4A）。轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌組織內(nèi)均分布著大量的EV71抗原，與和野生型小鼠比兩者間差異明顯（圖4B）。表明表達(dá)人SCARB2可促進(jìn)EV71對轉(zhuǎn)基因小鼠組織的感染，證實該蛋白在體內(nèi)可發(fā)揮EV71受體的功能。

SCARB2轉(zhuǎn)基因動物模型，無特定病原體(specific-pathogen free，SPF) ICR小鼠，6周齡，雌性，體重18-20g。

背景品系為ICR封閉群小鼠， Hauschka用Swiss小鼠群以多產(chǎn)為目標(biāo)，進(jìn)行選育，以后美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research）分送各國飼養(yǎng)實驗，各國稱為ICR。

人腸道病毒71型（EV71）是微核糖核酸病毒科腸病毒屬腸病毒種A型RNA病毒， 1969年首次在加利福尼亞神經(jīng)異常的病人體內(nèi)分離并鑒定。EV71被認(rèn)為是嬰幼兒手足口病(HFMD)的主要病原體之一。該病毒感染偶爾伴隨嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括腦干腦炎、無菌性腦膜炎、肺水腫或肺出血、急性弛緩性麻痹和心力衰竭。最近幾十年，EV71感染引起的手足口病疫情在世界范圍內(nèi)大爆發(fā)，目前主要集中于亞太地區(qū)。中國大陸的EV71病毒感染始見于1987年冬季湖北省HFMD的流行，自1999年以來，我國廣東、福建、上海、重慶等地區(qū)也報告了局部流行的EV71感染，與1998年臺灣地區(qū)報道120,000例爆發(fā)手足口病，其中有78例死亡不同，大陸EV71引起的HFMD和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀較輕。以往研究認(rèn)為人脊髓和腦干是EV71感染的靶標(biāo)，但其感染機制和致病機制尚不明確。

2009年日本學(xué)者首次利用細(xì)胞實驗鑒定了EV71的兩種人受體蛋白，分別為P選擇素糖蛋白配體1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)和人清道夫受體B2（SCARB2）。通過建立表達(dá)PSGl-1的轉(zhuǎn)基因小鼠，我們證實人PSGL-1有一定的促進(jìn)EV71感染轉(zhuǎn)基因小鼠的功能。為進(jìn)一步在體內(nèi)證實人SCARB2的受體功能，以期改良現(xiàn)有的EV71感染小鼠模型，我們通過建立表達(dá)人SCARB2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，在體內(nèi)驗證了該蛋白的受體功能。